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游离脂肪酸(FFA)含量检测试剂盒说明书

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详细介绍

游离脂肪酸(FFA)含量检测试剂盒说明书

可见分光光度法

注意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

规格:50T/48S

产品内容:

提取液:液体 50 mL×1 瓶,室温保存。

试剂一:自备。实验前一天,取一个玻璃瓶,按照正庚烷:无水甲醇:氯仿=24:1:25 的比例配置(自备),盖紧后混匀,室温保存。

试剂二:液体 16 mL×1 瓶,室温保存。

试剂三:粉剂×2 瓶,4℃保存。临用前每瓶加入 32mL 无水乙醇充分溶解,4℃可保存一周。标准品:粉剂×1 支,10mg 棕榈酸,室温保存。临用前把试剂转移到 10 mL 玻璃瓶中,加入

7.8 mL 氯仿充分溶解,即为 5μmol/mL 的棕榈酸标准溶液。

产品说明:

FFA 既是脂肪水解的产物,又是脂肪合成的底物。血清中 FFA 的浓度与脂类代谢、糖代谢、内分泌功能有关。

FFA 与铜离子结合形成脂肪酸铜盐,并溶于氯仿;利用铜试剂法测定铜离子含量,即可推算出游离脂肪酸含量。

自备仪器和用品:

研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、一个 40mL 玻璃瓶、一个 10 mL 玻璃瓶、正庚烷、无水甲醇、氯仿(三氯甲烷)、无水乙醇和蒸馏水。

操作步骤:

一、样品中 FFA 提取:

1、血清中FFA 测定:将所取血液,室温静置 1 h 后,于 4 ℃离心机 3500 rpm 离心 15min,取上层血清置于-20℃冰箱保存,待测。

2、组织中 FFA 含量测定:组织用生理盐水冲洗干净后,用吸水纸吸取表面水分,称取约 0.1g,加入 1.0 mL 提取液,匀浆后,8000rpm,4℃离心 10min,取上清液,待测。

二、测定:

1.分光光度计预热 30 min 以上,调节波长到 550 nm,无水乙醇调零。

2.试剂二在 37℃水浴中预热 30 min 以上。

3.标准品的稀释:将标准品用氯仿稀释成 1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05μmol/mL。

4.按下表在 1.5mL 离心管中加入相应试剂

对照管测定管空白管标准管

蒸馏水(μL)50

样本(μL)50

氯仿(μL)50

标准品(μL)50

试剂一(μL)500

试剂二(μL)200

充分振荡 10min 后,3000rpm,离心 10min

上层溶液(μL)200

试剂三(μL)800

充分振荡 2min 后,静置 15min,于 550 nm 下测吸光值,分别记为 A 对照管、A 测定管、A 空白管、A 标准管。(对照管和空白管各只做一管)

三、FFA 含量计算:

1.标准曲线的绘制:

以标准溶液的浓度为 x 轴,以ΔA 标准(ΔA=A 标准管-A 空白管)为 y 轴,绘制标准曲线,得到方程 y=kx+b。将ΔA(ΔA=A 测定管-A 对照管)带入方程得到 x。

2.血清中 FFA 含量计算

FFA(μmol/L)=1000x

3.组织中 FFA 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

FFA 含量(μmol/mg prot)=x×V 样总÷(Cpr×V 样总)=x÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

FFA(μmol/g 鲜重)=x×V 样总÷W

V 样总:上清液总体积,1 mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样品鲜重,g。1000:单位换算系数,1L=1000mL。

注意事项:

(1)试剂三配制应尽量晚配,可在操作到加入试剂二时,再配制试剂三。

(2)必须保证每管的震荡频率及时间一致。

(3)尽量在 30min 内完成测量,并且测完后要密封好再丢弃。

(4)因所用试剂多数为有机溶剂,同一支吸头多次吸取会造成体积不准确,建议更换吸头。

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