蛋白提取相关知识介绍

蛋白作为生命活动的基本功能单位， 是经典的生物标志物， 常用于蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）、蛋白质免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）、染色质免疫沉淀（ChIP）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegel electrophoresis，PAGE）实验等。为了实现我们的研究目的， 需要将蛋白从细胞组织中提取分离出来， 这一过程即为蛋白提取，提取出高质量的蛋白是后续实验成功的先决条件。

在分离之前， 需要用一定的方式进行细胞裂解， 细胞裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解（包括SDS和溶菌酶处理等） 通常是比较温和的方法， 通常会很少使DNA断裂，是提取纯化蛋白时常用的方法。机械裂解可以更均一的裂解细胞， 同化学裂解相比， 机械处理更剧烈和更全面， 具有更高的裂解效率和更低的选择性，但也会造成DNA的断裂。

常用的蛋白类型

根据细胞内定位的不同一般可以分为总蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白、核蛋白。在提取过程中要注意以下事项：

1. 膜蛋白

通过匀浆适度破碎细胞， 经低速离心去除细胞核和少数未破碎的细胞产生的沉淀， 随后取上清高速离心获得细胞膜沉淀和含有细胞浆蛋白的上清， 然后通过优化的膜蛋白抽提试剂从沉淀中抽提获取膜蛋白。抽提的膜蛋白不仅包括质膜上的膜蛋白，也包括线粒体膜、内质网膜和高尔基体膜等上的膜蛋白。

2. 胞浆蛋白

在低渗透压条件下， 使细胞充分膨胀， 然后破坏细胞膜， 释放出细胞浆蛋白，选用合适的抽提试剂进行提取操作。

3. 核蛋白

在低渗透压条件下， 使细胞充分膨胀破坏细胞膜后， 通过离心得到细胞核沉淀，通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。

不同样本类型的提取方法（以总蛋白为例）

1. 培养的细胞

(1) 贴壁细胞

① 倒掉培养液，将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）；

② 每瓶细胞（一般需要5*10 6细胞） 加预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）清洗后弃去洗液。重复以上操作两次， 共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上；

③ 每瓶细胞加含PMSF的裂解液， 于冰上充分裂解，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动；

④ 裂解完后， 用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快）， 然后用枪将细胞碎片和裂解液移至新的离心管中（整个操作尽量在冰上进行）；

⑤ 于4℃下12000rpm离心20min。（提前开离心机预冷）；

⑥ 将离心后的上清分装，于－80℃保存。

(2) 悬浮细胞

离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。

(3) 加药的贴壁细胞

由于受药物的影响， 一些细胞脱落下来，所以除按贴壁细胞操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

① 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min；

② 弃上清，加入PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次；

③ 用枪吸干上清后， 加100μL裂解液（含PMSF）冰上裂解， 裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解；

④ 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心20min，取上清分装并置于－80℃保存。

2. 组织细胞

组织样品的蛋白抽提时，必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑制剂cocktail），操作如下：

(1) 将少量剪碎的组织块置于玻璃匀浆器中， 加入裂解液裂（含PMSF）进行冰上匀浆。

(2) 充分裂解后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心20min，取上清分装并置于－80℃保存。

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