CY3标记

CY3标记反应原理：
Reactive CY3专一的与伯胺反应（N-末端及赖氨酸残基侧链）形成稳定的酰胺键

CY3标记.png

操作过程：
实验前准备：

1. 仔细阅读使用说明书。

2. 计算待使用Reactive CY3的量。

3. 提前20 min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（注：不需要用到的Reactive CY3继续放置冰箱中）。

4. 溶解Reactive CY3：加入20 μL DMF至Reactive CY3瓶中，静置10 min，待其充分溶解，此时CY3的浓度为10 mM。

操作步骤：（本操作步骤按照1 mg的量进行标记）

1. 取1 mg待标记抗体于Filtration tube中，并加入相应体积的 Labeling Buffer至总体积为0.5 mL，12,000× g离心10 min。（注：①Filtration tube的最大体积为0.5 mL。②待标记抗体浓度低时，可先超滤离心一次。）

2. 加入13.3 μL Reactive CY3 和适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使抗体的终浓度为2 mg/mL，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育60 min。

3. 12,000 × g离心10 min。

4. 加入适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使终体积为0.5 mL，并轻轻吹打混匀，12,000×g离心10 min。并重复操作一次。

5. 加0.2 mL Labeling Buffer至Filtration tube中，轻轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中，6,000×g离心10 min。

6. 收集离心管中的溶液，即为CY3标记的抗体。

注意事项：

1. 本试剂盒也可标记其它含有氨基（NH2-）的抗原、HRP、多肽，具体标记比例根据待标记物中氨基的数量确定。

2. DMF要密封干燥保存，使用完立即用封口膜封紧。

3. 操作步骤5中，可用Labeling Buffer作为回收标记抗体的缓冲液，也可使用其它任何缓冲液或保护剂。

4. 本试剂盒未开封前的有效期为一年，请在有效期内使用。

5. 本试剂盒提供的为10 kDa的Filtration tube，标记抗原或多肽请注意分子量的大小。

6. 在步骤2中，标记其它抗体时，我们应先控制抗体的终浓度为2 mg/mL，然后再根据抗体的量计算应加入Reactive CY3的体积。

7. 要确定在偶联中不引入游离氨基（Tris，氨及叠氮钠均可与活化CY3反应，因此会降低蛋白与CY3的偶联率）。

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