流式细胞术实验操作步骤

流式细胞技术（Flow cytometry, FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物，它能有效地从单细胞水平区分异质性细胞群体，检测对象包括但不限于悬浮细胞、贴壁细胞或从实体组织分离的单细胞悬液和其他生物颗粒。

一、细胞表面染色步骤

1.细胞准备：

1.1 采集全血或组织（脾，淋巴结，胸腺和骨髓等），用细胞染色buffer（或PBS）制成单细胞悬液。对于体外刺激的细胞，直接将刺激后的细胞悬浮在细胞染色buffer（或PBS）中，然后进行第2步。

1.2 加满细胞染色buffer（或PBS）, 1000 rpm 离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。

2. 红细胞裂解：

2.1 如果需要裂解红细胞（如脾脏），将10×红细胞裂解液（RBC）用H2O稀释到1×，放置到室温。将细胞重悬于3 mL 1 × RBC中，室温孵育5分钟。

2.2 加入10 mL细胞染色buffer（或PBS）终止红细胞裂解，1000 rpm离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。

2.3 重复洗涤一次，同步骤1.2。

2.4 细胞计数，用细胞染色buffer（或PBS）将细胞制成1×107 /mL悬液。将100 μL细胞悬液加入流式管中备用。

3. 封闭Fc受体：

        封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。小鼠中，纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，可加入5-10 μg/mL的Anti-Mouse CD16/32单抗100 μL，冰上孵育10分钟。对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断。

4. 细胞染色：

4.1 按照说明书的推荐用量加入荧光标记的抗体，混匀后置于冰上，避光孵育30分钟。

4.2 加入5 mL FACs buffer (或PBS) 重悬细胞，1000 rpm离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。

4.3 加入0.5 mL FACs buffer(或PBS)重悬细胞，用流式细胞仪进行检测和分析。

注意事项

1. 在抗体使用之前，快速离心一下，使之聚集到管的底部。

2. 荧光标记的抗体应该避光4℃保存，不要冷冻。

3. 当染色的时候，固定或延迟分析可能降低某些抗体的荧光信号。为了得到更好的结果，染色后应该马上分析。

二、细胞内细胞因子染色步骤

1. 细胞准备：

1.1 收集细胞，用细胞染色buffer（或PBS）制成单细胞悬液，调整细胞浓度约为1 × 107/mL。

1.2  如需裂解红细胞，将红细胞裂解液(RBC)稀释至1×，并平衡至室温，用适量的1×红细胞裂解液将细胞悬起，室温避光孵育10分钟；加入细胞染色buffer（或PBS）终止裂解，1000 rpm离心5分钟，弃去上清。加入细胞染色buffer（或PBS）重复洗涤一次，调整细胞浓度约为1 × 107/mL。

1.3 取100 μL细胞/管（约1 × 106细胞），分别加到已经标记好的流式管底部。

2. 固定：

2.1 如需要表面染色，则依照“细胞表面染色步骤"选用适宜抗体进行表面染色。然后用稀释至1×的细胞固定/破膜液（Fixation/Permeabilization buffer），将流式管中的细胞悬起，室温避光孵育30分钟。

2.2 1000 rpm离心5分钟，弃去上清。

3. 破膜：

3.1 用稀释至1×细胞破膜buffer将固定过的细胞悬起，1000 rpm离心力离心5分钟，弃去上清。

3.2 重复洗一次，1000 rpm离心5分钟，弃去上清。

3.3 加入1 mL 1×细胞破膜buffer，4℃避光孵育30分钟；1000 rpm离心5分钟，弃去上清。

4. 胞内染色：

4.1 用100 μL 1×细胞破膜buffer重悬细胞，加入相应的抗体，混匀，4℃避光孵育至少30分钟。

4.2 加入2 mL 1×细胞破膜buffer悬起细胞，1000 rpm离心5分钟，弃去上清。

4.3 加入2 mL细胞染色buffer（或PBS）悬起细胞，1000 rpm离心5分钟，弃去上清。

4.4 加入0.5 mL细胞染色buffer（或PBS）重悬细胞，用流式细胞仪进行检测和分析。

注意事项

1. 同一个细胞同时做细胞表面和细胞内的蛋白，建议先做细胞表面染色，再固定、破膜。

2. 细胞内染色推荐使用同型对照。

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