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免疫沉淀CHIP实验中要注意的事项有哪些?
点击次数:675 更新时间:2022-09-14
  染色质免疫沉淀技术(ChIP)通过与染色质片段共沉淀技术,在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。ChIP技术最大的优点就是在活体细胞状态下研究了蛋白质和目的基因结合状况,减少了体外实验的误差。在活体细胞中,先对与调节蛋白结合的染色质进行分离,然后随机剪切染色质,用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质,最后用QPCR、DNA测序的方法进行检测研究。
  因为免疫沉淀的目的主要是通过抗体和目的蛋白相互作用从而捕获目的蛋白,所以实验中要注意的关键点是抗体和目的蛋白相互作用的效果。其主要受抗体的结合能力,目的蛋白和抗体的可接触性两个因素影响。所以免疫沉淀实验中的关键因素是抗体的选择以及裂解缓冲液中的配方。对于前者而言,抗体所针对的作用表位必须处于目的蛋白表面,对抗体结合力的要求和免疫印迹或者免疫荧光相比要高得多;对于后者而言,主要考虑因素是缓冲液中的去垢剂成分能否在不破坏目的蛋白天然构像的情况下(不影响目的蛋白和抗体的相互作用效果)将目的蛋白从细胞局部定位(比如位于某些细胞器中)中有效释放出来。
  在所有免疫沉淀相关实验中,抗原的起始浓度相对其它免疫相关实验(WB和IF等)要低得多,所以对抗体的亲和力相对其它实验提出了更高的要求,这就需要使用高亲和力的抗体去进行免疫沉淀相关实验。同时,由于免疫沉淀相关实验主要是在生理条件下进行,所以需要抗体识别蛋白的天然表面构像,因此选择的抗体其针对的抗原决定簇需要暴露在蛋白表面。

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