货号：YJ2275 规格：50管/24样
Ca++ Mg++-ATP 酶活性测定说明书
可见分光光度法
产品说明：
Ca++ Mg++-ATP 酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP水解生成ADP和无机磷。根据Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定无机磷的量来确定ATP 酶活性高低。
需自备的仪器及用品：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体50mL ×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 5ml×1 瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×3 支，-20℃保存。用时每支加1mL 蒸馏水，现用现配。用不完的试剂-20℃可保存一周。
试剂五：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂六：粉剂×1 瓶，4℃保存。用时加入3mL 蒸馏水， 4℃保存。
试剂七：粉剂×1 瓶，4℃保存。用时加入25mL 蒸馏水，溶解后4℃保存一周。
试剂八：粉剂×1 瓶，4℃保存。用时加入25mL 蒸馏水，溶解后4℃保存一周。
试剂九：液体25mL×1 瓶，室温保存。
试剂十：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂十20倍稀释，即取 0.1mL试剂十加1.9mL蒸馏水
充分混匀
定磷剂的配制：按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂建议用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
样品酶液的制备：
- 细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
- 血清（浆）样品：直接检测。
操作步骤：
- 分光光度计预热30min 以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
- 酶促反应（在EP 管中加入下列试剂）
| 对照管 | 测定管 |
试剂一（μL） | 130 | 90 |
试剂二（μL） | 40 | 40 |
试剂三（μL） | 40 | 40 |
试剂四（μL） | 40 | 40 |
试剂五（μL） |
| 40 |
样本 （μL） |
| 200 |
混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴10min。 | ||
试剂六（μL） | 50 | 50 |
样本 （μL） | 200 |
|
混匀，8000g，常温离心10min，取上清液 | ||
- 定磷（1.5mLEP 管中依次加入下列试剂）
| 空白管 | 标准管 | 对照管 | 测定管 |
0.5μmol/ml 标准磷应用液（μL） |
| 100 |
|
|
上清液（μL） |
|
| 100 | 100 |
蒸馏水（μL） | 100 |
|
|
|
定磷试剂（μL） | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混匀，室温放置30 min，在 660nm 处比色。
注意事项：
- 由于每一个样都必须做对照，本试剂盒50管只能测24份Ca++ Mg++-ATP 酶。
- 此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是检测成败的关键。
- 空白管和标准管只要做一管。
计算
- 血清（浆）Ca++ Mg++-ATPase 活力的计算:
定义：规定每小时每毫升血清（浆）中Ca++ Mg++- ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力（U/mL）=[ C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A空白管）÷V 样÷T=7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）
- 组织、细菌或细胞中Ca++ Mg++- ATPase 活力的计算：
- 按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白中Ca++ Mg++- ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
ATP 酶活力(U/ mg)=[C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷（V 样×Cpr）÷T =7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷Cpr
- 按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/g)= [C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(W× V 样÷V样总)÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W
- 按细菌或细胞密度计算：
定义：规定每小时每1万个细菌或细胞中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/104)= [C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(500×V 样÷V样总)÷T=0.015×（A测定管-A 对照管）÷（A标准管-A空白管）
C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.5mL；V 样：加入样本体积，0.2mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6 小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
