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一、蛋白双向 电泳实验服务实验技术简介

2D-WB是双向电泳与传统western blot结合而成的一项技术。一般实验流程 为抗原蛋白混合物先经双向电泳分离,然后将凝胶蛋白转印至支持膜上，再通过抗体杂交显色。2D-WB技术可以检测到抗原等电点或分子量发生的微小变化，在蛋白翻译后修饰的研究中有很好的应用;而2D-WB结合质谱鉴定技术，可以从蛋白混合物中找到免疫原性更强的抗原。

二、蛋白双向 电泳实验服务概述

2D-WB是双向电泳与传统western blot结合而成的一项技术。一般实验流程 为抗原蛋白混合物先经双向电泳分离，然后将凝胶蛋白转印至支持膜上，再通过抗体杂交显色。2D-WB技术可以检测到抗原等电点或分子量发生的微小变化，在蛋白翻译后修饰的研究中有很好的应用;而2D-WB结合质谱鉴定技术，可以从蛋白混合物中找到免疫原性更强的抗原。

三、服务内容

1、蛋白质抽提与定量;

2、双向电泳;

3、转膜，封闭，孵育,显示成像。

四、实验操作流程

1、第--项电泳(IEF) ,胶条平衡，第二项电泳SDS-APGE.

2、第二项电泳结束后，取出凝胶进行转膜，转膜方法可选择湿法转移和半干法转移。常用的膜是NC膜和PVDF膜。

3、封闭，5%脱脂奶粉或5% BSA封闭1小时(室温)或过夜(4度)。

4、一抗孵育,根据抗体说明书选择孵育时间，常规的孵育条件是室温1小时或4度过夜，一抗孵育后取出膜

TBST洗涤3次，每次5分钟。

5、二抗孵育:根据一抗选择合适的二抗(抗鼠、抗人、抗兔等)，室温孵育1小时后取出膜TBST洗涤3次,每次5分钟。

6、显影:将A、B底物按比例稀释混台均匀后滴在膜上，暗室中将胶片置于膜上,盖上压片夹,曝光一定时间后将胶片放入显影液中进行显影，直到出现清晰的蛋白质条带，清水漂洗一下后在定影液中定影， 曝光时间需综台考虑蛋白质的上样量，抗体稀释浓度，抗体孵育时间等因素。

7、定影后，清洗胶片，晾干，标定marker,扫描图片和2D Western blot图片分析。

送样须知，为了保证2D Western blot技术服务能顺利进行,样品寄送需满足以下要求:

1、顾客提供:组织、细胞、蛋白质溶液等; 一抗(可交由研谨公司代购)。

2、运输要求:干冰或液氮包装寄送。

注:样本应避免各类污染和反复冻融。

五、技术服务报告内容

1、蛋白质定量结果及电泳上样量;

2、原始胶片、电子图片及图片分析结果;

3、2D Western blot完整的实验报告，包括实验步骤、使用仪器和试剂等。

附: 2D Western blot实验步骤

1、2D Western blot蛋白质样本制备,制备的主要原则是尽可能溶解全部蛋白质，破坏蛋白质与蛋白质间的相互作用，避免各类干扰物质，样品制备与IEF兼容等。

2、双向电泳的主要步骤，第-项电(IEF) ，胶条平衡，第二项电泳SDS-APGE.

3、第二项电泳结束后，取出凝胶进行转膜，转膜方法可选择湿法转移和半干法转移。常用的膜是NC膜和PVDF膜。

4、封闭， 5%脱脂奶粉或5% BSA封闭1小时(室温)或过夜(4度)。

5、-抗孵育,根据抗体说明书选择孵育时间，常规的孵育条件是室温1小时或4度过夜，一 抗孵育后取出膜TBST洗涤3次，每次5分钟。

6、二抗孵育:根据-抗选择合适的二抗(抗鼠、抗人抗兔等)， 室温孵育1小时后取出膜TBST洗涤3次，每次5分钟。

7、显影:将A、B底物按比例稀释混合均匀后滴在膜上,暗室中将胶片置于膜上，盖上压片夹，曝光一定时间后将胶片放入显影液中进行显影，直到出现清晰的蛋白质条带，清水漂洗一下后在定影液中定影， 曝光时间需综合考虑蛋白质的.上样量，抗体稀释浓度，抗体孵育时间等因素。

8、定影后，清洗胶片，晾干，标定marker,扫描图片和2D Western blot图片分析。

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